AG Tumorzelldissemination

Hintergrund

Die Arbeitsgruppe unter der klinischen Leitung von Herrn Prof. Dr. Solomayer und Frau PD Dr. Fehm beschäftigt sich mit dem Phänomen der Tumorzelldissemination im Knochenmark sowie im Blut bei Patientinnen mit Mammakarzinomen oder anderen gynäkologischen Karzinomen. Dieses Phänomen wird dadurch charakteriesiert, dass bereits in Frühstadien der Erkrankung, Tumorzellen in die Blutzirkulation abgegeben werden und damit einen wichtigen Schritt in der Metastasierungskaskade darstellen.

Tumorzelldissemination = Streuung einzelner Tumorzellen aus dem Primärtumor in den Kreislauf

Nachweis von disseminierten Tumorzellen (DTZ) im Knochenmark:

So wurde im Jahr 2001 der Tumorzellnachweis im Knochenmark als Routineuntersuchung bei Patientinnen mit gynäkologischen Malignomen etabliert. Hierzu wurde eigens ein Knochenmarkslabor aufgebaut. Mittlerweile erfolgt der Tumorzellnachweis über verschiedene Detektionsverfahren. Zum einen über molekularbiologische Methoden, wie die RT-PCR oder Multiplex-PCR, zur Amplifikation von tumorspezifischer (m)RNA, zum anderen werden DTZ mittels epithelspezifischer Antikörper detektiert.

1. Dichtegradient                  2. Zytospin                     3. Immunhistochemie

"Goldstandard?-Verfahren zur Isolierung und Detektion von Tumorzellen im KM

1. Dichtegradientenzentrifugation des Knochenmarks

2. Anfertigung von Zytospins (106 mononukleäre Zellen / Zytospin)

3. Immunhistochemische Detektion der Tumorzellen mittels epithel-spezifischer Antikörper

Light Cycler

Molekularbiologische Detektionsmethode - RT-PCR

Bis 2006 konnten insgesamt über 2000 intraoperative Knochenmarkspunktionen komplikationslos durchgeführt werden. Die Ergebnisse wurden mit den klinischen Daten der Patientinnen in einer umfangreichen Datenbank zusammengeführt. Knochenmarksuntersuchungen an über 200 Patientinnen mit anderen gynäkologischen Karzinomen, wie z.B. Ovarial-, Zervix- und Korpuskarzinom (Link Poster), haben gezeigt, dass die Tumorzelldissemination nicht nur auf das Mammakarzinom beschränkt ist, sondern ein generelles Phänomen darstellt. Die Tumorzelldissemination ist unabhängig von Tumorgröße und Nodalstatus (Fehm et al., 2005).

Seit 2003 werden im Rahmen einer klinischen Studie bei Mammakarzinompatientinnen Knochenmarksrepunktionen im Verlauf der Krankheit durchgeführt, um die Bedeutung der Tumorzellpersistenz zu untersuchen. Die ersten Auswertungen haben gezeigt, dass trotz Primäroperation und adjuvanter Chemotherapie ca. 30% der Patientinnen eine Tumorzellpersistenz aufweisen. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass nicht nur der präoperative Nachweis von DTZ, sondern auch die Tumorzellpersistenz nach der adjuvanten Therapie mit einer schlechten Prognose assoziiert ist (Wiedswang et al. 2004, Janni et al. 2004). Die Arbeitsgruppe beteiligt sich derzeit in der Kommission Tumorzelldissemination an der Entwicklung sekundärer adjuvanter Studienkonzepte zur Eliminierung persistierender Tumorzellen (DTZ). (Poster Becker)

Blutnachweis

Zusätzlich beteiligt sich die Arbeitsgruppe seit 2005 an einer Multicenter-Studie zum seriellen Tumorzellnachweis im Blut und dessen klinischer Bedeutung für die Metastasenfrüherkennung. Verschiedene Studien haben zeigen können, dass sich Krebszellen über den Blutkreislauf und die Lymphbahnen im ganzen Körper verteilen. In der Regel sterben diese Tumorzellen im Blut rasch ab. Jedoch können einige dieser gestreuten Zellen in der Blutzirkulation überleben und möglicherweise dazu beitragen, dass die Erkrankung wieder auftritt. Mittlerweile gibt es sehr gute Verfahren diese Tumorzellen zu detektieren. Mit dem AdnaTestBreastCancer (Fa. AdnaGen AG) können Krebszellen im Blut sicher isoliert werden. Das Verfahren erkennt die für Tumorzellen typischen genetischen Veränderungen. Das Verfahren ist dabei so empfindlich, dass bereits einzelne Krebszellen in 5ml Blut identifiziert werden. Der AdnaTestBreastCancer ist ein in-vitro Diagnostikum, der aus zwei Teilen besteht.

1. AdnaTestBreastCancerSelect, dient der Anreicherung zirkulierender Tumorzellen aus dem peripheren Blut. Der Test ermöglicht die immunomagnetische Anreicherung von Tumorzellen über epitheliale und tumorassoziierte Antigene. Die malignen Zellen im peripheren Blut werden mit Antikörpern gegen die epithelialen und tumorassoziierten Antigene markiert. Die Antikörper sind an Magnetpartikel gekoppelt, so dass die markierten Zellen mittels eines Magnetpartikelkonzentrators isoliert werden. Dieses Lysat der isolierten Zellen wird mit dem zweiten Schritt AdnaTestBreastCancerDetect weiterverarbeitet.

2. AdnaTestBreastCancerDetect dient dem Nachweis einer Brustkrebsassoziierten Genexpression in isolierten Tumorzellen mittels RT-PCR. Der Test enthält Magnetpartikel, die zur Isolierung von mRNA aus dem mit Tumorzellen angereicherten Lysat verwendet werden. Nach reverser Transkription dient die gewonnene cDNA als Ausgangsmaterial für eine Multiplex-PCR zur weiteren Charakterisierung. Es werden drei Tumormarker und ein Kontroll-Gen amplifiziert. Dieses wird dann über eine Agarosegel-Elektrophorese mit Bilddokumentation oder ein alternatives Analysesystem (Bioanalyzer) ausgewertet. Damit erfolgt ein sicherer Nachweis, ob sich Tumorzellen im Blut befinden.

Auf Grund der umfangreichen Expertise wurden Prof. Solomayer / PD Fehm von der DSG beauftragt, einen internationalen Konsensus zum Tumorzellnachweis im Knochenmark zu initiieren, der mittlerweile fertiggestellt worden ist.

Charakterisierung von DTZ

Der wissenschaftliche Hauptschwerpunkt der Arbeitsgruppe liegt nicht nur in der Detektion, sondern auch in der weitergehenden Charakterisierung disseminierter Tumorzellen mittels Geno- und Phänotypisierung, um

1.) ein besseres Verständnis des Prozesses der Metastasierung zu entwickeln und

2.) eine direkte Untersuchung des Wirkungsmechanismus ?zielgerichteter? Therapieansätze zu ermöglichen.

1.Genotypisierung

Entsprechend dem Modell der Mehrschrittkarzinogenese sind Tumorentstehung und Progression durch die sukzessive Akkumulation von genetischen Alterationen bedingt. Diese bewirken eine Änderung der Zellregulationsmechanismen, die z.B. zu einer erhöhten Zellmobilität führen oder die Zelle befähigen, eine Angiogenese zu induzieren. Basierend auf diesem Modell, ist der Arbeitsgruppe gelungen, eine Genotypisierung von disseminierten Tumorzellen mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FisH) zur weitergehenden Charakterisierung durchzuführen. Hierzu konnte bereits an DTZ gezeigt werden, dass diese multiple genetische Aberrationen aufweisen. Es gelang auch erstmalig über den Vergleich des numerischen Abberationsmusters im DTZ und Primärtumor, zu beweisen, dass die im Blut und Knochenmark detektierten disseminierten Zellen von dem Primärtumor abstammen (Fehm et al. 2002a).

2.Phänotypisierung

a. HER2 Expression

HER2 (oder cerb 2 bzw. Her2 neu) ist ein Rezeptor, der in der Zellmembran von gesunden Brustdrüsenzellen sowie in der Zellmembran von manchen Mamma-Karzinomzellen zu finden ist. Er ist als schlechter Prognosefaktor angesehen, ermöglicht aber gleichzeitig die Einsetzung von Antikörper gegen diesen Rezeptor in der Brustkrebstherapie.

Die Frage, die die Arbeitsgruppe beantworten wollte war, ob auch die DTZ diese Rezeptoren in der Zellmembran aufweisen und man dadurch ihr Wachstum mit dem HER2-Antikörper blockieren kann.

Es wurde mittels Immunfluoreszenz der HER2-Status von DTZ bestimmt (Abbildung B) und anschließend mit dem Primärtumor verglichen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass eine Diskrepanz zwischen Primärtumor und DTZ in der HER2-Expression vorliegt, die auch für die Therapie mit Trastuzumab entscheidend sein kann.

b. M30 Expression

Der Nachweis apoptotischer Tumorzellen im Knochenmark mittels M30-Antikörper (Roche Diagnostics, Deutschland, Abbildung C) unterstützt die Hypothese, dass einige Tumorzellen nur eine begrenzte Zeit im Knochenmark persistieren können und dann absterben. Die Anwesenheit von apoptotischen DTZ in Knochenmark von Patientinnen mit MammaCa widerspiegelt die Antwort auf primäre Chemotherapie. Die Patientinnen mit partieller bzw. völliger Tumorremission nach neoadjuvanter Therapie, hatten öfter die apoptotischen DTZ im Knochenmark im Vergleich zu den ohne Remission oder mit Progression der Krankheit (Fehm,Gebauer,Solomayer et al)

c.ER Expression

Das Phänomen, dass Mamma-Karzinom eine Expression von verschiedenen Hormonrezeptoren aufweißt, ist schon seit langem bekannt und in mehreren Studien bewiesen. Es handelt sich vor allem um Östrogen- und Progesteronrezeptoren, was die Therapie des Mamma-Karzioms beeinflusst hat, indem man Hormone in die Therapie einsetzen könnte. Im Jahr 2005 hat die Arbeitsgruppe die Frage gestellt ob disseminierte Tumorzellen im Knochenmark auch Hormonrezeptoren exprimieren können. Es wurde mit Hilfe von Immunfluoreszenz der Östrogenrezeptor-Status (ER α) von DTZ bestimmt und mit dem Status von dem Primärtumor vergliechen (Abbildung A)

Durch die weitergehende Charakterisierung, konnte die Arbeitsgruppe bereits einen wesentlichen Beitrag zur Klärung der tumorbiologischen Bedeutung disseminierter Tumorzellen leisten.

3. Bisphosphonate

Sowohl für die Osteoporosetherapie als auch für die Therapie von Knochenkomplikationen, die durch das Mammakarzinom verursacht werden können, stellen Bisphosphonate eine moderne, sehr gut verträgliche und nebenwirkungsarme Substanzgruppe dar. Sie können durch ihre osteoprotektive Wirkung den Knochen vor Zerstörung schützen und folglich Skelettkomplikationen vermindern, was erheblich zur Verbesserung der Lebensqualität onkologischer Patientinnen beiträgt. Die klassischen Indikationen in der Gynäko-Onkologie sind die Hyperkalzämie und die tumorbedingten Osteolysen. Bei allen tumorbedingten Osteolysen sollten Bisphosphonate bereits bei Erstdiagnose der Knochenmetastase und lebenslang, auch bei Progression, zum Einsatz kommen. Zu empfehlen ist eine intravenöse Applikation, wenn es sich um ein akutes Ereignis (Hyperkalzämiesyndrom, starker Knochenschmerz) handelt. Bei der Prävention akuter Komplikationen (nicht schmerzhafte, asymptomatische Knochenmetastasen) können orale und intravenöse Formulierungen prognoseabhängig eingesetzt werden.

Der wesentliche Effekt der Bisphosphonate besteht in der Hemmung der Osteoklasten, also der Zellen, die zu einer Auflösung von Knochensubstanz führen. Studien haben gezeigt, dass Bisphosphonate auch durch andere komplexe Wirkmechanismen in der Lage sind, das Auftreten von Skelettmetastasen bei Brustkrebs zu reduzieren. Um diesen vielversprechenden Ansatz in der adjuvanten Mammakarzinomtherapie näher zu untersuchen, laufen an der Universitätsfrauenklinik Tübingen Studien mit Bisphosphonaten zur Prävention von Knochenmetastasen. Unter anderem wird die regelmäßige intravenöse Anwendung von Zoledronsäure (Zometa®), gegenwärtig das Bisphosphonat mit der höchsten Affinität zum Knochen, unter diesem Aspekt untersucht.

Sowohl für die Osteoporosetherapie als auch für die Therapie von Knochenkomplikationen, die durch das Mammakarzinom verursacht werden können, stellen Bisphosphonate eine moderne, sehr gut verträgliche und nebenwirkungsarme Substanzgruppe dar. Sie können durch ihre osteoprotektive Wirkung den Knochen vor Zerstörung schützen und folglich Skelettkomplikationen vermindern, was erheblich zur Verbesserung der Lebensqualität onkologischer Patientinnen beiträgt. Die klassischen Indikationen in der Gynäko-Onkologie sind die Hyperkalzämie und die tumorbedingten Osteolysen. Bei allen tumorbedingten Osteolysen sollten Bisphosphonate bereits bei Erstdiagnose der Knochenmetastase und lebenslang, auch bei Progression, zum Einsatz kommen. Zu empfehlen ist eine intravenöse Applikation, wenn es sich um ein akutes Ereignis (Hyperkalzämiesyndrom, starker Knochenschmerz) handelt. Bei der Prävention akuter Komplikationen (nicht schmerzhafte, asymptomatische Knochenmetastasen) können orale und intravenöse Formulierungen prognoseabhängig eingesetzt werden.

Der wesentliche Effekt der Bisphosphonate besteht in der Hemmung der Osteoklasten, also der Zellen, die zu einer Auflösung von Knochensubstanz führen. Studien haben gezeigt, dass Bisphosphonate auch durch andere komplexe Wirkmechanismen in der Lage sind, das Auftreten von Skelettmetastasen bei Brustkrebs zu reduzieren. Um diesen vielversprechenden Ansatz in der adjuvanten Mammakarzinomtherapie näher zu untersuchen, laufen an der Universitätsfrauenklinik Tübingen Studien mit Bisphosphonaten zur Prävention von Knochenmetastasen. Unter anderem wird die regelmäßige intravenöse Anwendung von Zoledronsäure (Zometa®), gegenwärtig das Bisphosphonat mit der höchsten Affinität zum Knochen, unter diesem Aspekt untersucht.

Phänotypisierung des zellulären Immunstatus bei Patientinnen mit einer Krebserkrankung

Für eine funktionierende Immunabwehr ist eine bestimmte Menge an aktivierten Granulozyten und Monozyten (unspezifische Abwehr) sowie T- und B-Lymphozyten (spezifische Abwehr) notwendig. Eine Störung des zellulären Immunstatus hat zur Folge, daß sich die Tumorzelle der Kontrolle des Immunsystems entziehen kann, und sich damit im Körper ausbreitet. Im Mittelpunkt unseres Interesses steht deshalb die Interaktion zwischen Tumorzelle und ihrer immunmodulatorischen Mikroenvironment, welche sowohl beim Ausbruch der Erkrankung als auch beim späteren Verlauf (Prognose) ein entscheidende Rolle spielt. In diesem Zusammenhang ist das Knochenmark als ?homing site? für disseminierte Tumorzellen zu verstehen. Dort können Tumorzellen aufgrund der Suppression der Immunüberwachung über Jahre persistieren (?schlafen?). Quantitative als auch qualitativ-funktionelle Analysen der Immunzellen sollen deshalb dazu dienen, die Mechanismen von ruhenden b.z.w reaktivierten Tumorzellen näher aufzuklären. Mittels Durchflußzytometrie wird der Immunstatus im Blut ( siehe Abbildung ) als auch im Knochenmark von Karzinompatientinnen ermittelt. Dabei werden Antikörper gegen solche zellulären Antigene eingesetzt, die konstant auf den Immunzellen exprimiert werden. Mit dieser Immunphäno-typisierung untersuchen wir insbesondere die Expression solcher Oberflächenmolekülen, die nach heutigen Kenntnisstand für die Aktivierung / Differenzierung tumorspezifischen naiver T-Zellen von entscheidender Bedeutung sind und die tumorspezifische Immunantwort des Körper beeinflussen.