AG Tumorprogression

Hintergrund

Die Arbeitsgruppe unter der klinischen Leitung von Prof. Solomayer und PD Fehm, sowie der molekularbiologischen Leitung von Dr. rer. nat. Neubauer beschäftigt sich mit der Identifizierung neuer Marker für eine individualisierte Prognose oder Prädiktion bei gynäkologischen Karzinomen. Das Hauptaugenmerk legt die Arbeitsgruppe dabei auf die funktionelle Validierung von Kandidatengenen/-proteinen.

Bei den Methoden stützt sich die AG auf die Lasermikrodissektion, mit der die zu analysierende Zellpopulation aus einem heterogenen Zellverband isoliert werden können. Proteomanalysen erfolgen in Zusammenarbeit mit dem Proteom Centrum Tübingen oder externen Kooperationspartnern. Microarrayuntersuchungen des Transkriptoms werden in Zusammenarbeit mit der Microarray Facility Tübingen durchgeführt.

Seit der Gründung der Gruppe im Jahre 2001 wurden folgende Projekte erfolgreich bearbeitet:

1) ?Breast cancer proteomics by laser capture microdissection, sample pooling, 54 cm immobilised pH gradient isoelectric focussing, and differential iodine radioisotope detection? (Neubauer et al. 2006) (gefördert durch BMBF-DHPG 01KW0102 ?Proteomanalysis of Breast Cancer Genes?)

Die Expression des Progesteronrezeptors (PR) in Östrogenrezeptor (ER)-positiven Mammakarzinomen ist mit einer guten Prognose assoziiert und zeigt an, dass Tumoren sehr wahrscheinlich auf Tamoxifen reagieren. ER+/PR- Tumoren dagegen sprechen schlechter an. Um einen potentiellen molekularen Mechanismus für dieses Phänomen zu identifizieren wurden invasiv duktale Karzinome kryokonservierter ER+/PR+ und ER+/PR- Mammakarzinome untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Tumorzellen mit Hilfe der LCM isoliert. Die Zelllysate wurden raioaktiv markiert und in einer hochauflösenden Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Differentiell dargestellte Spots wurden massenspektrometrisch identifiziert. Wir konnten zeigen, dass Zytochrom b5 und Transgelin in ER+/PR+ Tumoren reduziert und CRABP-II, Cyclophilin A, Neudesin, and Hämoglobin erhöht exprimiert sind. Dies deutet auf einen deregulierten Zytochrom b5-abhängigen Metabolismus hin.

2) Increased wound-response revealed by proteomics of Estrogen Receptornegative breast cancers (Neubauer et al., eingreicht)

In diesem Proteomprojekt wurden ER-negative und ER-positive Mammakarzinomproben verglichen. Dabei konnte die Arbeitsgruppe zeigen, dass ER-positive Mammakarzinome einen ?basalen? Phänotyp besitzen und dass ER-negative Mammakarzinome verstärkt Proteine exprimieren, die bei der Wundheilung wichtig sind (Neubauer et al, eingereicht bei ?Proteomics ? Clinical Applications?). Eines der Proteine, PGRMC1, wurde kürzlich in einem Wundheilungsexperiment als ein Protein nachgewiesen, das während der Wundheilung in einer Phase exprimiert ist, in der bereits die Reparatur des Gewebes einsetzt (Velardo et al., 2004). In unserer Studie konnten wir insgesamt drei Proteinsignale für PGRMC1 bestimmen, von denen zwei in ER-negativen Tumoren signifikant höher exprimiert sind.

Neben diesen Screening-Projekten interessiert uns die Expression und funktionelle Relevanz von Hormonrezeptor-Isoformen.

Im Laufe der letzten Jahre Für viele dieser neuen Formen ist ihre Funktion noch nicht genau definiert. Somit bildet sich ein immer komplexer werden Bild für die Wirkmechanismen von Hormonen und den therapeutisch eingesetzten Anti-Hormonen dar.

3) Östrogenrezeptor beta Isoformen als prädiktive Marker beim Mammakarzinom neoadjuvant behandelter Patientinnen

Bis Mitte der 1990er Jahre war eigentlich nur der ERAlpha bekannt und er avancierte zum wichtigsten prognostischen und prädiktiven Faktor beim Mammakarzinom. Die Entdeckung der Östrogenrezeptor beta Isoform 1996 zeigte aber, dass es auch eine eigenständige beta-Form des Östrogen-rezeptors mit diversen Splice-Varianten gibt. Dies gibt Anlass, den Hormonrezeptorstatus differenzierter zu betrachten und es stellt sich die Frage, ob die immunhistochemisch ermittelte Expressionsstärke von Östrogenrezeptor beta Isoformen in Zusammenhang mit dem Ansprechen auf eine endokrine oder zytostatische Therapie steht.

Neben der Immunhistochemie untersuchen wir die Expression der ERbeta-Isoformen mit Hilfe einer im Labor etablierten MultiPlex-RT-PCR.

4) ?Predicting resistance to platin-containing chemotherapy with the ATP tumorchemosensitivity Assay in Primary Ovarian Cancer (Neubauer et al, eingereicht).

Mit Hilfe des ATP-Tumorchemosensitivitäts-Assays messen wir die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Zytostatika und korrelieren die Ergebnisse mit klinischen Daten. Gleichzeitig untersuchen wir das Genexpressionsprofil dieser Tumoren mittels Microarrayanalyse um Mechanismen unterschedlicher Resistenzen zu identifizieren.

Invasion beim Mammakarzinom

Christina Schütz, Dr. rer. nat.

Ziel

Identifizierung, Validierung und Funktionsanalyse neuer molekularer Invasionsmarker

Hintergrund

Duktal invasive Mammakarzinome (IDC) entstehen über verschiedene nicht-maligne Präkanzerosen aus dem Epithel der Duktuli (milchabführende Gänge der Brustdrüse). Direkte Vorstufe ist das duktale Carcinoma in situ (DCIS; in situ = am Ort), bei dem die entarteten, proliferierenden Zellen nicht durch die Basalmembran dringen. Beim Übergang vom DCIS zum IDC werden die Zellen invasiv, d.h. sie erlangen Fähigkeit ins umliegende Brustgewebe einzuwandern, wodurch sie Zugang zu den Lymph/- und Blutgefäßen der Brust erhalten. Invasivität ist somit die Voraussetzung für eine systemische Ausbreitung einer ursprünglich lokalen Tumorerkrankung. Kausal am Invasionsprozess beteiligte Moleküle können im Hinblick auf die Entwicklung von Präventionsstrategien oder als Progressionsmarker bei Patientinnen mit nicht-invasiven Krebsvorstufen von Bedeutung sein.

Basis-Projekt:

Mittels Mikroarray-Analyse (Affymetrix) wurden Genexpressionsprofile von je DCIS- und IDC-Komponente (Patientinnen-gleiche Probenpaare, ?Matched Pairs?) von neun primären duktal invasiven Mammakarzinomen mit intraduktaler Komponente erstellt (Kooperation: Microarray Facility Tübingen). Analysiert wurde homogenes epitheliales Zellmaterial, welches durch die Anwendung der Lasermikrodissektion aus Schnitten kryokonservierter Tumorproben isoliert worden war. Beim Vergleich der Genexpressionsprofile der neun Patientinnen-gleichen Paare konnte ein Set signifikant differentiell exprimierter Gene identifiziert werden (Kooperation: Zentrum für Bioinformatik Tübingen). Dieses Set beinhaltet bekannte Gene/Genprodukte, bei denen eine Rolle bei der Tumorinvasion/-progression beim Mammakarzinom beschrieben ist (z.B. MMP11 und PLAU/uPA). Der Serumlevel des PLAU Proteins hat weiterhin prognostische Relevanz beim Mammakarzinom. Um aufzuklären, ob weitere Gene mit noch unbekannter Funktion für die klinische Anwendung interessant sein könnten, wurden 20 differentiell regulierte Gene für eine weitere Validierung ausgewählt. Die differentielle Genexpression wurde experimentell mittels ?Real-Time? RT-PCR validiert. Durch In situ-Hybridisierung und/oder immunhistochemische Färbungen mit spezifischen Antikörpern wurde das Transkript bzw. das Protein von insgesamt acht Kandidaten in epithelialen Tumorzellen lokalisiert (Schuetz et al., Cancer Res. 2006 May 15;66(10):5278-86).

Folge-Projekte:

Im Rahmen von Folgeprojekten (z.B. Diplomarbeit Y. Wachtel) wird nun für verschiedene Kandidaten untersucht, ob ein kausaler Zusammenhang zwischen Expressionslevel (Exprerimente: Überexression, bzw. siRNA-vermittelte Gensuppression im Zellkulturmodell) und Invasivität (z.B. Matrigel-Experimente) besteht.

Kooperationsprojekte der AG Tumorprogression:

1) ?Analysis of modified nucleosides in cell culture supernatants of breast cancer cell lines MCF7 and SKBR 3 by LC-ITMS? (Bullinger, Neubauer et al., eingereicht)

Als endogene Komponenten des zellulären Metabolismus können Nukleoside und deren Analoga als biomedizinische Indikatoren eingesetzt werden. Krankheiten mit erheblichen metabolischen Veränderungen wie Krebs zeigen charakteristische Veränderungen des RNS-Turnovers, der in erhöhten Mengen modifizierter Nukleoside in Körperflüssigkeiten wie z.B. dem Serum oder im Urin führen.

In diesem Pilot-Projekt untersuchen wir die Überstände verschiedener Mammakarzinomzelllinien (MCF7, SKBR3) und vergleichen die erhaltenen Nukleosid-Muster mit der dem der Brustzelllinie MCF10A.

Ziel ist die Analyse von Serumproben.

2) ?Metabolomics of Breast Cancer Samples?

Eine neue Methode bei der Bestimmung von Krankheiten ist das Gebiet des ?Metabolomics? oder ? metabolite profiling?, mit der der metabolische Phänotyp von Krebszellen und der Antwort des ?Wirtes? auf den Tumor gemessen werden kann. Metabolite profiling combiniert Techniken der analytischen Chemie mit multivariaten statistischen Methoden um zahlreiche Species gleichzeitig zu untersuchen (Odunsi et al., Int. J. Cancer (2005) 113, 782; Chen et al., Rapid Comm. Mass Spec. (2006) 20, 1577). Mit Hilfe dieses Ansatzes untersuchen wir im Serum von Mammakarzinompatientinnen die Effekte chemotherapeutischer Behandlungen.

3) Bedeutung der Protein kinase C beta II beim Mammakarzinom

Protein kinase C (PKC) ist eine Familie von mindestens 12 unterschiedlichen Serine/Threoninekinasen, die in verschiedene zelluläre Funktionen wie Proliferation, Differenzierung, Apoptose, Tumorbildung, Angiogenese und Chemotherapeutika-Resistenz involviert ist. Auch hier gibt es zahlreiche Isozyme. Daher wollen PKC  Spleiß-Varianten I und II bestimmen um ihre Bedeutung beim Mammakarzinom zu verstehen. Die Expression von PKCβI und βII könnte unterschiedlich reguliert sein.

Publikationsliste der AG Tumorprogression:

Originalpublikationen:

Benohr P, Henkel V, Speer R, Vogel U, Sotlar K, Aydeniz B, Reiser A, Neubauer H, Tabiti K, Wallwiener D, Clare SE, Kurek R. Her-2/neu expression in breast cancer--A comparison of different diagnostic methods. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1895-900.

Schuetz CS, Bonin M, Clare SE, Nieselt K, Sotlar K, Walter M, Fehm T, Solomayer E, Riess O, Wallwiener D, Kurek R, Neubauer HJ. Progression-specific genes identified by expression profiling of matched ductal carcinomas in situ and invasive breast tumors, combining laser capture microdissection and oligonucleotide microarray analysis. Cancer Res. 2006 May 15;66(10):5278-86.

Neubauer H, Clare SE, Kurek R, Fehm T, Wallwiener D, Sotlar K, Nordheim A, Wozny W, Schwall GP, Poznanovic S, Sastri C, Hunzinger C, Stegmann W, Schrattenholz A, Cahill MA. Breast cancer proteomics by laser capture microdissection, sample pooling, 54-cm IPG IEF, and differential iodine radioisotope detection. Electrophoresis. 2006 May;27(9):1840-52.

Kamenisch Y, Wenz J, Metzler G, Bauer J, Neubauer H, Garbe C, Rocken M, Berneburg M. The Mitochondrial DNA Common Deletion Is Present in Most Basal and Squamous Cell Carcinoma Samples Isolated by Laser Capture Microdissection but Generally at Reduced Rather than Increased Levels. J Invest Dermatol. 2006 Oct 12

Reviews:

H Neubauer, C Schuetz, R Kurek, E Solomayer, and T Fehm. Genchip-Analysen ? schon Realität?. Current Congress, 25. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Senologie. 2005

Hans Neubauer, Christina Schuetz, Erich Solomayer, Tanja Fehm. Duktales Carcinoma in situ ? molekulare Marker finden High-Risk-Patientinnen. Frauenarzt 47 (2006): 1006-1009.

H Neubauer, R Speer, C Schuetz, E Solomayer, T Fehm: Proteomanalyse beim Mammakarzinom. Senologie, in press 2006

Hans Neubauer, Tanja Fehm, Christina Schuetz, Runa Speer, Erich Solomayer, André Schrattenholz, Michael Cahill, Raffael Kurek. Proteomic Expression Profiling of Breast Cancer, Targeted Therapies in Cancer, in press 2007.

Hans Neubauer, Christina Schuetz, Erich Solomayer, Tanja Fehm. Genchip-Diagnostik ? schon Routinediagnostik?, Senologie, in press 2007

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